Eule und Lerche | Untersuchung genetischer Varianten und ihre Auswirkungen auf den Chronotyp

• Die Schüler:innen erklären die Auswirkungen von circadianer Rhythmik auf das menschliche Verhalten an ausgewählten Beispielen.
• Sie können die Notwendigkeit einer PCR erklären und detailliert den Reaktionsmechanismus zur Amplifikation der DNA beschreiben.
• Die Lernenden können das Funktionsprinzip einer Gelelektrophorese beschreiben.
• Sie wenden molekularbiologische Arbeitstechniken selbstständig an.
• Mit Blick auf die Interpretation der Versuchsergebnisse können die Schüler:innen differenziert zur Anlage-Umwelt-Debatte Stellung nehmen.

Inhaltsbezogene Kompetenzen
3.3.1 Genetik (Sek I) bzw. 3.4.4 Molekularbiologie (Sek II):

Die Lernenden können

• … die Struktur der DNA anhand eines einfachen Modells beschreiben und erklären, wie Informationen in der DNA gespeichert sind.
• … an einfachen Erbgängen die Ausprägung des Phänotyps und dessen Vererbung auf den Genotyp erklären.
• … Werkzeuge und Verfahren der Molekularbiologie erläutern (PCR, Gelelektrophorese)

Prozessbezogene Kompetenzen:
2.1 Erkenntnisgewinnung: Die Lernenden können

• … biologische Arbeitstechniken (PCR, Gel-Elektrophorese, Mikropipetten) anwenden.

Mithilfe einfacher labortechnischer Methoden analysieren Schüler:innen ihren eigenen Genotyp und sie vergleichen das Ergebnis mit dem Chronotyp, den sie mit einem elaborierten Fragebogen ermitteln. Zur Analyse des Genotyps wird die Anzahl der VNTRs (= variable number tandem repeats) des PER3-Gens untersucht. Dies gelingt durch einen in drei Teilabschnitte untergliederten Versuchsablauf. Zu Beginn wird die DNA aus den Zellen der Mundschleimhaut der Schüler:innen extrahiert. Im zweiten Versuchsabschnitt wird mittels PCR ein Teil des PER3-Gens amplifiziert. In der darauffolgenden Doppelstunde führen die Lernenden im dritten und letzten Versuchsabschnitt eigenständig eine Gelelektrophorese durch, um die DNA-Fragmente im elektrischen Feld gemäß der Anzahl der Basenpaare aufzutrennen. Menschen mit vier Kopien der repeats neigen zur Aktivität in den Abendstunden (Eule), wohingegen fünf Kopien im Lokus des PER3-Gens auf einen Morgenmenschen (Lerche) hindeuten. Zum Abschluss der Unterrichtseinheit empfiehlt es sich die Aussagekraft des Versuchs zu diskutieren und auf weitere Einflussfaktoren der circadianen Rhythmik (z.B. Licht, Tag-Nacht-Wechsel) sowie der Ausprägung des menschlichen Verhaltens zu verweisen.

Was ist das PER3-Gen und wieso wurde es untersucht?
Das Gen ist homolog zum per-Gen der Taufliege Drosophila, einer der gängigsten Modellorganismen der Genetiker. In Drosophila steuert es ebenfalls die circadiane Rhythmik. Aus diesem Grund weckte das per3-Gen das Interesse der Forscher, um Schlafstörungen auch im Menschen zu untersuchen. Das Forscherteam um Simon Archer stellte einen Zusammenhang zwischen der Anzahl der variable number tandem repeats (= VNTRs) und der Präferenz für eine bestimmte Tageszeit fest. Personen, welche sich selbst durch einen Fragebogen als Morgenmenschen (= Lerchen) identifizieren tendieren dazu 5 dieser Repeats innerhalb ihres per3-Gens aufzuweisen. Eulen (= "Nachtmenschen") hingegen besitzen häufiger nur 4 dieser 54-basenpaareumfassenden Sequenz.

Wie werden Gene und Proteine korrekt geschrieben?
In der Biologie ist eine präzise Fachsprache unerlässlich. Aus diesem Grund wird die Nomenklatur von Genen des Menschen durch das HUGO Gene Nomenclature Committee eindeutig festgelegt. Dabei gilt es zu beachten, dass menschliche Gene groß und kursiv geschrieben werden (Bsp.: PER3). Das zugehörige Protein eines Gens wird ebenfalls großgeschrieben, jedoch wird zur eindeutigen Unterscheidung auf die kursive Schreibweise verzichtet (Bsp.: PER3). Die Nomenklatur von Genen und Proteinen ist jedoch nicht für alle Lebewesen identisch, sondern ist für jeden Organismus unterschiedlich.

Wie kann festgestellt werden wie viele Repeats sich in einer Genkopie befinden?
Mittels PCR kann in kürzester Zeit eine Vielzahl von Kopien eines Abschnittes des PER3-Gens hergestellt werden. Über eine Gelelektrophorese können DNA-Moleküle gemäß ihrer Länge aufgetrennt werden. Entscheidend ist nun ob in der amplifizierten Sequenz 4 oder 5 Repeats vorliegen, da dadurch letztlich das DNA-Fragment um 54 BP länger oder kürzer ist. Diese Differenz in der Länge des Gens kann durch eine Gelelektrophorese aufgetrennt werden, so dass der Genotyp ermittelt werden kann.

Wieso befinden sich in meiner Auswertung 2 Banden?
Im Ergebnis der Gelelektrophorese können auch zwei Banden auftreten. Das liegt daran, dass menschliche Zellen jeweils den zweifachen Chromosomensatz enthalten. Man bezeichnet sie folglich auch als diploid. Heterozygote Menschen verfügen demnach jeweils über einen Chromosomensatz der vier Repeats im PER-Gen enthält, während der andere Chromosomensatz 5 Repeats beinhaltet. In der Gelelektrophorese wandern die DNA-Fragmente dann gemäß ihrer Länge unterschiedlich weit. Dadurch entstehen die zwei Banden.

Homozygote Menschen besitzen auf beiden Chromosomensätzen die identische Anzahl an Repeats in der untersuchten Sequenz. Die beiden Sequenzen haben logischerweise dieselbe Anzahl an Basenpaaren. Deshalb legen sie in der Gel-Elektrophorese auch die gleiche Strecke zurück. In der Auswertung findet sich aus diesem Grund nur eine sichtbare Bande.

Kann vom Genotyp direkt auf den Chronotyp geschlossen werden?
Nein, das ist nicht möglich. Merkmalseigenschaften sind immer das Produkt aus einer Vielzahl von Allelen und den Einflüssen der Umwelt. Manche Studien zeigen eine Korrelation zwischen dem Tag/Nacht-Rhythmus und der Anzahl an VNTRs innerhalb des PER3-Gens. Um statistisch signifikante Aussagen treffen zu können ist eine möglichst große Stichprobe notwendig, doch selbst wenn diese gegeben ist, kann aus dem Genotyp nicht direkt auf den Chronotyp geschlossen werden, da auch Umwelteinflüsse beachtet werden müssen. Beispielsweise sinkt die benötigte Schlafenszeit, wenn Probanden während ihrer Wachphasen reellem Tageslicht ausgesetzt sind und wird des Weiteren auch durch das endokrine System beeinflusst (Roenneberg et al. 2003).

Durch die Arbeit im LaboraTRI lernen die Schüler*innen die molekularbiologischen Methoden zur Ermittlung des für den eigenen Chronotyp relevanten Genotyps kennen. Eine wichtige Lektion ist dabei die reflexive Auseinandersetzung mit der Anlage-Umwelt-Debatte, welche im Unterricht zur Molekularbiologie stets berücksichtigt werden sollte.

Quellen
Archer, Simon N.; Robilliard, Donna L.; Skene, Debra J.; Smits, Marcel; Williams, Adrian; Arendt, Josephine; Schantz, Malcolm von (2003): A length polymorphism in the circadian clock gene Per3 is linked to delayed sleep phase syndrome and extreme diurnal preference. In: Sleep 26 (4), S. 413–415. DOI: 10.1093/sleep/26.4.413.

Halberg, Franz; Cornélissen, Germaine; Katinas, George; Syutkina, Elena V.; Sothern, Robert B.; Zaslavskaya, Rina et al. (2003): Transdisciplinary unifying implications of circadian findings in the 1950s. In: Journal of circadian rhythms 1 (1), S. 2. DOI: 10.1186/1740-3391-1-2.

Roenneberg, Till; Wirz-Justice, Anna; Merrow, Martha (2003): Life between clocks: daily temporal patterns of human chronotypes. In: Journal of biological rhythms 18 (1), S. 80–90. DOI: 10.1177/0748730402239679.
Schantz, Malcolm von; Archer, Simon N. (2003): Clocks, genes and sleep. In: Journal of the Royal Society of Medicine 96 (10), S. 486–489. DOI: 10.1258/jrsm.96.10.486.

Welche Stolpersteine gibt es bei der Versuchsdurchführung?

DNA-Extraktion:
Die DNA-Extraktion mittels Instagene-Matrix-Methode beherbergt keine nennenswerten Durchführungsschwierigkeiten. Es ist jedoch darauf zu achten, dass das verwendete IG-Tube auf Eis gelagert werden muss.

PCR-Durchführung:
Auch die Chemikalien der PCR, wie beispielsweise den PCR-Mastermix, den Primer Mix, die Heterozygoten-Probe und die DNA-Leiter sollten auf Eis gelagert werden. Um eine gute Verteilung der Reagenzien in den Eppendorfgefäßen zu gewährleisten, wird empfohlen diese unmittelbar vor ihrer Nutzung durch einen Vortexer zu durchmischen. Steht kein solches Gerät zur Verfügung ist das Schnippen des Gefäßes über die Aussparungen des Laborracks ausreichend. Die Handhabung der Pipette und das Pipettieren besonders kleiner Volumina bereitet manchen Schüler:innen zu Beginn Schwierigkeiten. Damit diese das Versuchsergebnis nicht beeinflussen empfiehlt es sich vorab eine Pipettier-Übung durchzuführen. Über die App minipcr kann der Temperaturverlauf des Thermocyclers programmiert werden. Außerdem bietet die App eine animierte Echtzeitdarstellung der molekularen Abläufe während der PCR, welche für das Verständnis der molekularen Prozesse der Polymerase-Kettenreaktion hilfreich sein kann. Obwohl die App intuitiv verständlich ist empfiehlt es sich, diese in der Vorbereitung zu testen und den zugehörigen Thermocycler per Bluetooth zu verbinden.
Agarose-Gele gießen (vor der Durchführung vorzubereiten): Bevor die PCR-Produkte in der Gelelektrophorsekammer aufgetrennt werden, müssen die Agarose-Gele gegossen werden. Dabei gilt es zu beachten, dass der Heizblock sowie der verwendete Erlenmeyerkolben stark erhitzen und deshalb eine Gefahrenquelle für Verbrennungen darstellen. Außerdem sollte die Agarose-Mischung stets im Blick behalten werden, da sie leicht überkochen kann. Der verwendete DNA-Farbstoff pepGreen wird als ungefährlich eingestuft. Dennoch muss darauf geachtet werden, dass alle Schüler:innen stets Handschuhe tragen, wenn in deren Nähe mit Chemikalien gearbeitet wird, auch wenn diese nach heutigem Kenntnisstand als unbedenklich eingestuft werden.

Durchführung der Gelelektrophorese:
Die Schüler:innen dürfen ihre Proben selbst in die dafür vorgesehenen Taschen, also die Aussparungen im Gel, pipettieren. Um möglichst gute Versuchsergebnisse zu erzielen ist es wichtig, die Pipette genau über der Tasche zu positionieren und die DNA-Probe dann langsam aus der Pipettenspitze ins Gel abzugeben. Dieser Vorgang erfordert etwas Feinmotorik sowie ein wenig Übung. Aus diesem Grund empfiehlt es sich ein Dummy-Gel, beispielsweise aus Agarose und Wasser, herzustellen (Link zur Anleitung einfügen). Anstelle von DNA-Proben können die Schülerinnen mit Lebensmittelfarben üben die Taschen des Gels zu befüllen. Nachdem die Schüler:innen das Agarose-Gel erfolgreich beladen haben wird die Gel-Elektrophorese durch das Anlegen der Spannung gestartet. Um bestmögliche Versuchsergebnisse zu erhalten, wird empfohlen die Laufstrecke der DNA-Fragmente gelegentlich durch Einschalten des Blaulichts zu überprüfen, um sicher zu stellen, dass die Proben nicht aus dem Gel wandern. Dennoch sollte das Blaulicht während der Durchführung der Gelelektrophorese nicht dauerhaft eingeschaltet bleiben, da sonst die Gefahr besteht, dass die Fluoreszenz langsam an Intensität verliert.

Welche didaktischen Reduzierungen wurden vorgenommen und weshalb?
Bei sämtlichen didaktischen Reduktionen gilt es zu beachten, dass die Lerninhalte für die Lernenden vereinfacht und verständlich, aber nicht verfälscht dargestellt werden sollen. Ziel der Durchführung des Versuchs ist es, dass die Schüler:innen ihr theoretisches Wissen zur PCR und dem Funktionsprinzip der Gel-Elektrophorese sichern indem sie diese in Anleitung eigenständig durchführen. Aus diesem Grund erhalten sie bereits fertige Agarose-Gele. Das spart wertvolle Zeit und die Nachwuchsforsch:innen können sich auf die relevanten Labortechniken konzentrieren. Zudem erhalten sie den PCR-Mastermix vorportioniert, da dessen Herstellung Sicherheit im Umgang mit den Pipetten erfordert und ebenfalls zeitintensiv und fehleranfällig ist.

Welcher Arbeitsaufwand kann für die Vor- und Nachbereitung der Versuche veranschlagt werden?
Die Vor- und Nachbereitungen des Versuchs sind aufgrund der Anzahl der benötigten Geräte und Chemikalien eher zeitintensiv, jedoch nicht anspruchsvoll. Die verhältnismäßig aufwendige Vorbereitung der Arbeitsplätze sollte in das Zeitmanagement mit einberechnet werden. Außerdem müssen die Agarose-Gele vorbereitet werden, was mit etwas Übung jedoch nicht viel Zeit in Anspruch nimmt. Vorteilhaft ist, dass diese, wenn sie durch eine Gefriertüte luftdicht verpackt sind, bis zu 3 Tagen im Kühlschrank gelagert werden können. Das Experiment besteht aus mehreren Teilversuchen und daher wird eine hohe Anzahl an Materialien und Geräten benötigt. Die Unterrichtsstunden können ideal als praktische Vertiefung oder als Abschluss einer Unterrichtseinheit zur Genetik durchgeführt werden. Der Arbeitsaufwand wird dadurch legitimiert, dass die Schüler*innen im Rahmen einer Doppelstunde die wichtigsten praktischen Methoden der molekularen Biologie erlernen. Zur Nachbereitung müssen die Gele entsorgt und die Geräte angemessen gereinigt werden (zur Reinigung der Elektrophoresekammer unbedingt das BlueGel-Spray und kein Desinfektionsmittel verwenden).

• Sicherheitsdatenblätter
• Versuchsprotokoll (Lehrer:innen)
• Versuchsprotokoll (Schüler:innen)
• Arbeitsblattvorschlag