Das Farbrennen - Wie funktioniert eine Gelelektrophorese?

Was ist ein genetischer Fingerabdruck und wofür kann er benutzt werden?

Bereits im siebten Jahrhundert unterzeichneten Händler in China ihre Verträge mit dem Fingerabdruck. Zu diesem Zeitpunkt war bereits bekannt, dass Unterschriften leicht kopiert werden können, ein Fingerabdruck hingegen unnachahmlich ist. Gleichermaßen einzigartig ist die Abfolge der Basen der DNA jedes Menschen. Dieser genetische Fingerabdruck findet seit Jahren in der Kriminalistik zur Verbrechensaufklärung Anwendung.

Welche Abschnitte der DNA werden für den genetischen Fingerabdruck verwendet?

Zur Feststellung der genetischen Identität werden sogenannte STRs (=short tandem repeats) analysiert. Diese Abschnitte der DNA codieren nicht für Proteine, weshalb sich Mutationen darin nicht auf den Phänotypen auswirken. Sie bestehen, wie in Abbildung 1 dargestellt, aus einer Serie von sich wiederholenden Elementen (= den repeats) mit einer Größe von zwei bis zehn Nukleotiden. STRs eignen sich hervorragend, um die Vaterschaft zu klären, da sie in der Anzahl ihrer repeats zwischen jedem Menschen variieren.

Als diploide Organismen erhält jeder Mensch einen Chromosomensatz von seinem Vater und einen Chromosomensatz von seiner Mutter. Die Eltern vererben dadurch unverkennbar die Anzahl ihrer repeats innerhalb eines STRs.

Wie werde die STRs genau analysiert?

Zu Beginn wird mittels PCR (=polymerase chain reaction) der zu untersuchende DNA-Abschnitt amplifiziert, da die Menge der in der Probe enthaltenen DNA nicht ausreichen würde, um später detektiert zu werden. Eine PCR lässt sich in drei Teilsequenzen untergliedern. Zu Beginn werden die DNA-Doppelstränge bei 95°C denaturiert. Das Abkühlen der Temperatur im Thermocycler leitet den zweiten Schritt, das sogenannte Primer-Annealing ein. Dabei binden spezifische Primer (kurze Oligonukleotide) temperaturabhängig (ca. 60°C) an DNA-Abschnitte in der Nähe des STRs, welcher untersucht werden soll. Ausgehend von diesem Primern synthetisiert eine hitzestabile DNA-Polymerase (bei meist 72°C) die komplementären Basenpaare zur DNA-Vorlage, welche zu Beginn eines weiteren Zyklus wieder denaturiert werden. Durch die richtige Wahl der Primer wird dabei sichergestellt, dass lediglich der DNA-Abschnitt, welcher die zu untersuchenden STRs trägt, exponentiell vermehrt wird.

Je nach Anzahl der repeats hat der vervielfältigte Abschnitt eine bestimmte Anzahl an Basenpaaren. Über eine Gel-Elektrophorese können DNA-Abschnitte gemäß ihrer Länge aufgetrennt werden und anhand der charakteristischen Bandenmuster kann die mögliche Vaterschaft zweifelsfrei geklärt werden. In der Realität verwendet man hierfür eine Kapillarelektrophorese, da die Längenunterschiede bei den STRs zu klein sind um sie durch die im Modellversuch angewandte Agarose-Gelelektrophorese, aufzutrennen. Im Modellversuch wird jedoch eine Gel-Elektrophorese verwendet, da die Geräte kostengünstiger sind, die Versuchsdurchführung auch ohne Vorwissen gelingen kann und die anschließende Interpretation anhand von farbenfrohen Ergebnissen Lernenden leichter fällt.

Wie viele STRs werden bei einem Vaterschaftstest untersucht und wie zuverlässig sind diese Tests?

Um eine Vaterschaft zu testen werden mindestens 15 STRs analysiert. Dabei müssen Proben und Einverständnis des Vaters, der Mutter und des Kinds vorliegen. Die Zuverlässigkeit der Tests, wenn 15 oder mehr Marker untersucht werden beträgt 99,9 %. Vor deutschen Gerichten gilt eine Vaterschaft damit als praktisch erwiesen. 

Wieso wandern die DNA-Fragmente unterschiedlich schnell durch das Agarose-Gel?

Je höher die Agarose konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren des Agarosegels, welche die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle auf dem Weg zur Anode durchlaufen. Die Poren funktionieren dabei wie ein Sieb, welches kleine Moleküle schnell und problemlos passieren lässt, große Moleküle jedoch abbremst. Aus diesem Grund wandern DNA-Fragmente mit weniger Basenpaaren im Gel schneller als die DNA-Fragmente, welche aufgrund zusätzlicher repeats mehr Basenpaare besitzen.

Wie werden die DNA-Banden innerhalb des Agarose-Gels nachgewiesen?

Um die Banden sichtbar zu machen, wurde früher beispielsweise der Farbstoff Ethidiumbromid, verwendet. Die Chemikalie interkaliert in die DNA. Dort absorbiert sie Licht einer spezifischen Wellenlänge. Nachdem ihre Elektronen auf ein höheres energetisches Niveau versetzt werden, fallen sie auf ihr Ausgangsniveau zurück. Die Wellenlänge des Lichts, welches die Elektronen beim Zurückfallen auf ihr Ausgangsniveau abgeben entspricht der Energiedifferenz der beiden Zustände.  Ethidiumbromid stellt jedoch aller Wahrscheinlichkeit nach ein Karzinogen dar, denn es interkaliert nicht nur in die Proben-DNA. Auch unsere eigene DNA ist nicht vor der Chemikalie geschützt.

In diesem Modellversuch kann auf solche Chemikalien jedoch ganz verzichtet werden, da Lebensmittelfarbstoffe die DNA simulieren.